La Sala Mezzofanti è dedicata al cardinale poliglotta Giuseppe Gaspare Mezzofanti (1774-1849), professore di lingue orientali all’Università di Bologna, bibliotecario dapprima alla Biblioteca dell’Istituto delle Scienze e, successivamente, dopo il suo trasferimento a Roma, alla Biblioteca Vaticana con il ruolo di “Primo custode”.
Frutto di un ampliamento degli spazi della biblioteca realizzato nei primi anni dell'Ottocento, è decorata da una volta affrescata e da un pavimento a palladiana dipinta. L’arredo è costituito da scaffalature provenienti dalla biblioteca del Convento di San Francesco a Bologna.
Oggi contiene i materiali più preziosi del patrimonio della Biblioteca: i manoscritti e i rari.