Luigi Ferdinando Marsili (1658-1730), nobile bolognese e generale dell'Impero, creò nel 1712 l'Istituto delle Scienze e lo dotò delle proprie collezioni scientifiche, dei suoi libri, di 900 manoscritti orientali e di 120 manoscritti relativi alle sue opere.
Nel 1742 questo primo nucleo della Biblioteca si arricchì di manoscritti e opere a stampa, nonché della raccolta delle tavolette xilografiche e degli acquerelli del grande naturalista bolognese Ulisse Aldrovandi.
Nel settembre del 1755, Papa Benedetto XIV (Prospero Lambertini, 1675-1758) fece dono alla Biblioteca dell'Istituto di circa 25.000 volumi a stampa e di 450 manoscritti. Nello stesso anno, impose ai tipografi di Bologna la consegna obbligatoria di ogni opera stampata e, nell'anno successivo, decretò l'apertura al pubblico della Biblioteca, che avvenne nel 1756.
La crescita del Patrimonio della Biblioteca, conseguente alle donazioni papale e del cardinale Monti, impose la modifica e l'ampliamento dell'edificio. Fu così costruita la nuova sala di lettura monumentale, detta Aula Magna, che Papa Benedetto XIV fece realizzare dall'architetto Carlo Francesco Dotti (1670-1759).
Alla fase di consolidamento subentrarono i mutamenti determinati dalla dominazione francese: sul piano patrimoniale essa comportò un notevole apporto di libri e manoscritti, provenienti dalle soppressioni conventuali del 1797.
Con il primo decreto bibliotecario dell'Italia unita (1869), la Biblioteca entrò a far parte delle biblioteche governative più importanti e nel 1885 fu inserita tra le universitarie.
Negli anni 30 del Novecento fu aggiunta l’ala di raccordo che affaccia su Piazza Puntoni, ora sede degli uffici della direzione e dello staff della sezione antica, oltre che degli uffici amministrativi. Nello stesso periodo furono aggiunti i tavoli in Aula Magna, per trasformare l’ambiente lambertiniano in una capiente sala di lettura.
Nel 2000 fu sottoscritta la convenzione fra l’Ateneo e il Ministero dei Beni Culturali per il trasferimento della biblioteca sotto la gestione dell’Università di Bologna. Il processo si è concluso nel gennaio del 2017.
Come Biblioteca Universitaria, è stata oggetto di numerose donazioni che hanno dato origine a fondi speciali.
A partire dagli anni 90 del Novecento, si è affiancata a quella storica di Palazzo Poggi la nuova sede, con due grandi e confortevoli sale di consultazione e la Torre libraria, nella quale hanno già trovato posto 400.000 volumi, oltre ai magazzini compact per i periodici.